DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE DOENÇAS INFECCIOSAS EM GESTANTES

Roseane Lima Verde

            As doenças sexualmente transmissíveis (DST) estão entre os agravos à saúde mais comuns no mundo inteiro e têm apresentado aumento da morbidade e da mortalidade, ocasionando também agravos como doenças congênitas, infertilidade, aumento do risco para infecção pelo HIV e abortos prematuros (Rodrigues-Junior, et al., 2004). Para contornar e resolver este problema deve ser feita uma ampla campanha educativa visando a redução do comportamento de risco para estas infecções, como também, disponibilizar o fornecimento de insumos como preservativos femininos, masculinos e o acesso ao diagnóstico destas populações vulneráveis (Brito, et al., 2007).
         A epidemiologia molecular, alicerçada nos fundamentos da genética, biologia molecular e bioestatística, constituem um ramo da ciência voltada para o diagnóstico e monitoramento preciso de doenças infecciosas em gestantes, desta forma, estas ferramentas contribuirão de forma significativa nas áreas de vigilância epidemiológica e controle de epidemias virais. O sequenciamento e a PCR tem também comprovado a sua aplicabilidade na clínica, proporcionando a detecção específica de agentes infecciosos em suas espécies, genótipos e subtipos.

            O Brasil possui o maior número de infectados pelo HBV, HCV, HIV, HTLV da América do Sul, tendo prevalências variáveis entre regiões (Pereira,et al., 2013). A ocorrência de doenças sexualmente transmissíveis (DST) durante a gravidez representa risco aumentado de morbidade e mortalidade para o feto e o neonato, em virtude da transmissão vertical (Lima, et al., 2009), podendo essas doenças estar associadas à gravidez ectópica, abortos, natimortos e prematuridade, além de infecções congênitas, perinatais e puerperais (Figueiró-Filho, et al., 2005).

            Em 1981, nos EstadosUnidos da América, foi identificada a síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), após relatos de imunodeficiência em homossexuais jovens do sexo masculino (Gottlieb, et al., 1981). Mais tarde, sintomas semelhantes foram observados em pacientes hemofílicos que receberam hemoderivados previamente purificados e filtrados em filtros bacteriológicos e, como esses filtros não impediram a passagem do vírus, este ocorrido despertou a atenção para que o possível agente etiológico da AIDS pudesse ser um vírus (Montagnier, 2010).

          A infecção pelo HIV apresenta um quadro de alta gravidade e de caráter pandêmico, tornando-se um dos maiores problemas de saúde pública mundial da atualidade.

          O avanço da epidemia de AIDS em mulheres na idade fértil nos países em desenvolvimento, traz como consequência um maior número de crianças sob o risco da transmissão vertical do HIV-1.  No Brasil apesar da implementação de medidas profiláticas para transmissão vertical desde 1996, só no período de janeiro/2009 a junho/2010, um total de 346 novos casos de transmissão materno infantil do HIV-1 foram registrados (Brasil, 2010).

            Durante a gravidez, a mulher apresenta um número de risco aumentado para aquisição de doenças sexualmente transmissíveis (DST), devido à ocorrência de alterações no sistema imunológico que predispõem a gestante a doenças infecciosas, tornando-se um dos problemas mais comuns do período gestacional (Freitas, 2005).

             A transmissão vertical do HIV pode ocorrer durante a gestação (35%), o trabalho de parto e o parto propriamente dito (65%), ou através da amamentação, com risco acrescido de transmissão entre 7% e 22% a cada exposição (mamada) (Febrasgo, 2004). Porém, segundo (Jourdain,et al., 2007), a maioria dos casos de transmissão de mãe para filho ocorre na fase tardia  da gestação, durante o trabalho de parto e no parto propriamente dito.

             Para (Kourtis,et al., 2001), a transmissão intrauterina pode ser mediada, por infecções que alteram a permeabilidade e seletividade placentária ou microtransfusões materno-fetais. (Kourtis,et al., 2011) relata que mesmo ainda não sendo possível descobrir o momento da infecção intrauterina, vários compartimentos virais maternos como: vírus circulante no plasma, secreções vaginais e leucócitos infectados, ajudam na transmissão durante a gestação.

            Em alguns países em desenvolvimento, as mulheres infectadas conhecem o risco adicional da amamentação materna, sendo orientadas para a troca da amamentação com leite artificial. No Brasil, o aleitamento materno é proscrito através de um banco de leite e a alimentação mista, que seria o leite humano mais fórmula infantil, assim como o uso do leite humano com pasteurização domiciliar (Brasil, 2010)

             A OMS tem como uma de suas metas, o controle mundial da AIDS, almejando que nenhuma criança seja exposta ao HIV-1 na gestação e/ou durante o parto (UNAIDS/WHO, 2010). Para que esta meta seja alcançada, é preciso garantir que toda a população mundial tenha o acesso precoce aos testes de diagnóstico da infecção pelo HIV-1, através da triagem de infecção pelo HIV-1 no pré-natal. Esta triagem da infecção pelo HIV-1 em mulheres de idade fértil permite tratamento e introdução de profilaxia da transmissão materno infantil, reduzindo os riscos de casos neonatais.

            Quando as mães têm seu diagnóstico de infecção pelo HIV previamente ao momento do parto, seus filhos apresentam melhor sobrevida e prognóstico, provavelmente devido a maiores oportunidades para tratamento apropriado e profilaxia para infecções oportunistas nessas crianças (Doerholt,et al., 2006). Informações sobre as características imunológica, viral e epidemiológica de gestantes infectadas pelo HIV-1 podem indicar medidas mais eficazes para o diagnóstico, profilaxia e terapia.

           Ainda como agravantes frequentemente observados no âmbito da gestação temos as hepatites, que podem ser de diferentes tipos e transmissão, dependendo do agente etiológico. Em virtude da incidência de pessoas infectadas e de suas complicações, as hepatites virais se tornaram importantes no campo da saúde pública (Patel, 2011).

            A hepatite C tem sua transmissão como principal via a parenteral e em indivíduos expostos a transfusão de sangue, indivíduos que compartilham objetos perfurantes ou usuários de droga injetáveis, sendo pouco frequente por via sexual (Patel, 2011). Possui seis genótipos (1-6) e múltiplos subtipos que apresentam distribuição geográfica variável. Os genótipos 1, 2 e 3 apresentam uma distribuição mundial. Os subtipos 1a, 1b, 2a, 2b e 3a são encontrados no Brasil (Alter, 2007).

            Em relação à hepatite B, sua transmissão se faz principalmente por via sexual, ocorrendo também transmissão vertical (filho de mãe portadora). Este vírus é a principal causa de hepatopatia crônica no mundo. Admite-se que cerca de 400 milhões de pessoas estejam infectadas por esse agen­te e que 15 a 40% dos indivíduos com a infecção irão desenvolver cirrose, insuficiência hepática ou carcinoma (Conceição, et al., 2009). Dados epidemiológicos demonstram que a transmissão vertical é responsável por 35 a 40% dos novos casos de hepatite B no mundo e é por meio dela que o vírus é mantido na população (Lee, et al., 2006). Classicamente, admite-se que a evolução para infecção crônica ocorre em 90% das crianças infectadas no período neonatal, sobretudo naque­las cujas mães apresentam HBsAg e HBeAg positivos no momento do parto (Lima, et al., 2009; Conceição, et al., 2009).

          A epidemiologia molecular é um ramo da ciência biológica que se preocupa com a identificação e caracterização, de espécies, subespécies, genótipos e subtipos de microorganismo de interesse para a saúde humana e de animais, que utiliza as ferramentas de genética, bioestatística e biologia molecular para investigar surtos e epidemias.

                Segundo (Forattini, 2005)as investigações epidemiológicas, constituem-se numa ferramenta valiosa para identificar precisamente o agente infeccioso nas suas variabilidades e especificidades, transferindo ao laboratório de biologia molecular as observações necessárias ao entendimento destes processos infecciosos, com foco na busca da teoria causal ou etiológica.

            Após o surgimento do modelo estrutural do DNA em 1953, proposto por Watson-Crick, foi possível a elucidação da molécula de DNA.  Sendo possível, a criação de protocolos de clonagem, sequenciamento e hibridização do DNA permitindo seu posterior sequenciamento através da técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction), inventada em 1984 pelo bioquímico americano, Kary Banks Mullis, que recebeu o Prêmio Nobel de Química e o Prêmio Japonês pelo seu desenvolvimento em 1993.

            A PCR, utilizado no âmbito da biologia molecular, permite a análise de quantidades infinitesimais de DNA/RNA a partir da produção de milhões de copias da amostra original.  Esta técnica rapidamente se tornou uma das mais usadas em laboratórios por todo o mundo devido a sua simplicidade, rapidez e baixo custo, possibilitando a investigação, caracterização e o diagnóstico molecular de diversas doenças infecciosas (Joshi & Deshpande, 2010). Esta técnica apresenta um variado tipo aplicado ao diagnóstico:

·         PCR convencional - É uma técnica simples, onde, a molécula de DNA alvo é submetida a altas temperaturas (90 -97º C) o que provoca a desnaturação da dupla cadeia. Após a desnaturação, um par de pequenas sequências de DNA sintético, chamadas de primers, que são ligadas à molécula de DNA alvo (hibridação, ou hibridização  ou anelamento).  Estes servem como um ponto de para adição de nucleótideos, feita pela DNA polimerase.

·         PCR Multiplex – É amplamente utilizada em diversas áreas, na detecção e análise de genes, análise de polimorfismos, mutações, análise quantitativa, no contexto do RT-PCR (reverse transcriptase PCR), no diagnostico de doenças infecciosas para identificação de vírus, bactérias e parasitas (Elnifro, et al., 2000). Portanto, é uma extensão do PCR convencional, a vantagem do seu uso é a capacidade de amplificar mais do que uma sequência alvo simultaneamente, tornando-se  mais econômica e mais rápida(Ravikumar, et,  al.,  2011).

·         Nested PCR - é um método usado para aumentar a sensibilidade da PCR. É uma forma de reamplificação de  um  produto  da  PCR.  É executado uma primeira PCR o qual usa um par de primers que produzem uma grande quantidade de produto e é depois usado como um molde para a segunda amplificação (Bermingham,  2003).

·         RT-PCR - A Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) permite estudar o RNA via PCR. Este método é altamente sensível e específico para a detecção de cópias de RNA, principalmente quando a quantidade de amostra é limitada (Roche, 2003).

·         PCR em Tempo Real (qPCR)–Esta técnica constitui  uma das ferramentas mais  úteis dos   últimos   tempos.  Esta tecnologia deriva da PCR convencional, mais procura ultrapassar algumas das sérias limitações que esta apresenta. Ao proceder à amplificação da sequência de DNA e só depois se analisar o produto, a quantificação tornava-se extremamente difícil. Esta limitação foi ultrapassada em 1992 com o desenvolvimento do PCR em tempo real por Higuchi, et al. (Higuchi, et al., 1992). Na PCR em tempo real a quantidade de produto formado é  analisado  ao  longo  da reação, com a introdução de fluorocromos ou de sondas fluorescentes. A monitorização da fluorescência permite quantificar o produto formado (Kubista, et al., 2006).

PCR em Tempo Real

Sequenciamento

            A tecnologia de sequenciamento foi descrita pela primeira vez por Sanger em 1977 (Sanger, et  al., 1977), como   um   método   para   a   determinação   de nucleotídeos. Esta tecnologia permitiu, ao longo de duas décadas, um grande número de importantes avanços à nível da genética (Shendure & Ji, 2008). Assim, o método clássico de Sanger sofreu diversas modificações e adaptações ao longo dos anos, mais recentemente pela influência do Projeto Genoma Humano, o qual impulsionou a automatização e o aumento da rentabilidade da técnica (Moorthie, et al., 2011).

            A sequência é determinada após ser submetida a uma eletroforese de alta resolução em tubos capilares, onde os produtos são separados segundo o tamanho (Shendure & Ji, 2008). Assim que estes fragmentos marcados saem do capilar passam pelo detector, onde um laser excita os fluorocromos, produzindo emissões de fluorescência de quatro cores diferentes. A leitura da cor fluorescente emitida pelos fragmentos é processada por software especializado, que revela a sequência de DNA. (Smith, et al., 1987).

Esquema do processo de sequenciamento

Sequenciador de DNA automático AB 3500

 Sequenciador de DNA automático AB 3500 de 8 capilares

               

            Devido à sua diversidade de aplicações, o RT-PCR detecta diversos vírus de RNA, como o vírus da imunodeficiência humana (HIV), o vírus da hepatite C (HCV), o vírus T-linfotrópico humano (HTLV-1 e HTLV-2), enterovírus (EV), vírus sincicial respiratório (RSV), o vírus da influenza (Inf-Ae  Inf-B), rotavírus e outros vírus que causam gastroenterites. O RT-PCR pode também ser empregado na detecção de RNA mensageiro, útil no diagnostico de vírus de DNA que possuem uma fase latente durante o seu ciclo(Watzinger, et al., 2006).

            Em análises de amostras reduzidas, o qPCR  alia-se ao PCR multiplex para a  detecção simultânea de mais de um alvo, principalmente em amostras de líquido cefaloraquidiano onde  se suspeita  da existência de múltiplos vírus  neuroinvasivos. Pelo mesmo procedimento é possível detectar o vírus da hepatite B e C (HBV, HCV), o HIV-1, vírus da parainfluenza (PIV1-4),  o herpes simples vírus (HSV), o citomegalovírus (CMV), o vírus da varicela zóster (VZV), o vírus de herpes humano 6 (HHV-6), adenovírus, o vírus de Epstein-Barr (EBV) ou o vírus da raiva (Elnifro, et al., 2000).

            Desta forma, as técnicas e metodologias apresentadas, poderão ser utilizadas para o planejamento, desenvolvimento de estratégias e políticas públicas de contenção, diagnóstico e prevenção da transmissão viral em gestantes, como também, a transmissão vertical e possivelmente, para aperfeiçoar as estratégias de prevenção e controle das infecções pelos vírus da hepatite B, C, HIV e HTLV na população de gestantes do Piauí.

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